Оптимизация метода лентивирусной трансдукции с целью получения CAR-лимфоцитов

Фёдорова П.О., Чикилева И.О., Персиянцева Н.А., Замкова М.А., Киселевский М.В.

Научно-исследовательский институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Научно-исследовательский институт канцерогенеза ФГБУ «Научный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва
ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова, Москва

Эффективность проводимой CAR-терапии тесно связана с количеством иммунных клеток, экспрессирующих CAR. Для внедрения CAR-последовательности в геном лимфоцитов используются как вирусы, так и невирусные векторы, среди которых отдаётся предпочтение лентивирусному способу доставки генов. Однако эффективность лентивирусной трансдукции первичной культуры лимфоцитов остаётся существенно ниже по сравнению с аналогичным показателем при работе с перевиваемыми клеточными линиями. Целью данной работы являлась оптимизация метода трансфекции для получения лентивирусных частиц, а также повышение эффективности лентивирусной трансдукции. В данном исследовании получали лентивирусы, кодирующие последовательность белка GFP или CAR, проводили их концентрирование. Далее осуществляли трансдукцию перевиваемых культур клеток (HEK293T и Jurkat), первичной культуры лимфоцитов человека, а также фракции CD4+, CD8+лимфоцитов, полученных из первичной лимфоцитарной культуры. Оценивали уровень экспрессии GFP-белка или CAR, а также проводили селекцию лимфоцитов. Было установлено, что оптимальным вариантом концентрирования лентивирусов является центрифугирование с использованием PEG8000, а повышению эффективности трансдукции способствует использование липофектамина вместо кальций-фосфатного метода. Несмотря на высокие показатели трансдукции клеточной линии Jurcat, эффективность трансдукции лимфоцитов человека остаётся невысокой. Для увеличения экспрессии CAR (до 75-88%) были проведены, в независимых экспериментах, магнитная сепарация Т-клеток или селекция CAR-лимфоцитов бластицидином. Хотя данные подходы и позволили обогатить популяцию CAR-лимфоцитов, дальнейшее повышение эффективности генетической модификации лимфоцитов человека является приоритетной и требующей большого внимания задачей при получении CAR-клеток.